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論藥品微生物檢測實驗室的建立論文
微生物污染是藥品質(zhì)量評估的重要指標，目前各國藥典收錄的藥品無菌檢查和微生物限度檢查方法只對藥品終產(chǎn)品質(zhì)量進行評價，且對無菌檢查不合格的藥品要求不得進行復驗。藥品微生物檢測實驗室如缺少對實驗環(huán)境的監(jiān)督和控制，則無法評估微生物陽性結(jié)果的污染來源。而藥品檢測過程中的微生物陽性結(jié)果可能源于實驗過程中環(huán)境的污染，因此判斷檢出菌與環(huán)境菌的相關性，是排除實驗過程污染、減少假陽性結(jié)果、提高檢驗結(jié)果準確性的必不可少的環(huán)節(jié)。同時現(xiàn)階段藥品安全管理仍存在監(jiān)管漏洞，當藥品受到致病微生物污染時，往往出現(xiàn)定溯源難、應變慢等問題。若建立微生物檢測實驗室日常的環(huán)境微生物菌庫，則可較好地解決上述問題。目前國外通過分子生物學手段對病原微生物建庫的研究較多，如RIDOM website 提供根據(jù)16S DNA 序列的差異建立的病原微生物庫[4]。國內(nèi)對制藥環(huán)境建立環(huán)境微生物菌庫相關方面的研究也有報道，如PEI等[5]曾采用FTIR 法構(gòu)建潔凈室環(huán)境菌的FTIR 譜庫，但該方法對微生物的培養(yǎng)條件及預處理要求嚴格，隨機誤差也較大。目前在藥品微生物檢測實驗室建立環(huán)境微生物菌庫方面的研究仍較少。本研究從筆者工作的藥品微生物檢測實驗室環(huán)境中不同部位、設備材料及活動人員進行連續(xù)7個月采樣收集微生物，共獲得248 株細菌和6 株霉菌，對收集的細菌采用全自動微生物生化鑒定儀(Vitek2 Compact)進行鑒定，對生化鑒定無確切結(jié)果的90 株細菌及6 株霉菌均采用3500 MicroSeq基因測序分析系統(tǒng)進行細菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測序鑒定，并對某次采樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 進行同源性分析。通過對鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實驗室環(huán)境微生物庫，為今后本實驗室微生物檢測結(jié)果污染溯源調(diào)查提供了信息保障，同時也為制藥企業(yè)開展建立環(huán)境微生物信息庫和微生物污染溯源提供了技術指導。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑光學顯微鏡( 日本奧林巴斯) ; VITEK 2Compact 全自動微生物生化儀、全自動革蘭氏染色儀、Diversilab 同源性分析系統(tǒng)(法國梅里埃);梯度96 孔Verti PCR 儀(美國ABI 公司);PowerpacBasic 電泳儀(美國Bio-Rad 公司);3500 MicroSeq全自動微生物基因分析鑒定系統(tǒng)(美國ABI 公司)。
1.2 環(huán)境微生物的收集連續(xù)7 個月對微生物實驗室環(huán)境中不同部位、活動人員及設備材料采用胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環(huán)凱)平板，分別通過接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌采樣器(環(huán)境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環(huán)境沉降微生物取樣)及棉簽擦拭法(設備和材料表面取樣)進行微生物樣本采集，分離純化后共獲得248 株細菌和6 株霉菌，采用甘油凍存管置?70 ℃冰箱保存。
1.3 生化鑒定采用VITEK 2 Compact 對獲得的248 株細菌的新鮮培養(yǎng)物根據(jù)革蘭染色鏡檢結(jié)果選取GN、GP、BCL 不同鑒定試劑卡進行生化鑒定。
1.4 細菌16S rDNA 及霉菌LSU rDNA 測序鑒定對VITEK 鑒定無確切鑒定結(jié)果的90 株細菌及6 株霉菌分別采用3500 MicroSeq 全自動微生物基因分析鑒定系統(tǒng)進行細菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測序鑒定。采用3500 MicroSeq 系統(tǒng)配套試劑對90 株細菌和6 株霉菌的TSA 平板培養(yǎng)物分別進行DNA 抽提、PCR 擴增和純化、標記反應及標記反應純化，最后進行毛細管電泳測序。
1.5 6 株金黃色葡萄球菌的Diversilab 同源性分析某次采樣收集到6 株菌，采用VITEK 生化鑒定和16S rDNA 測序鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，且在所測16S rDNA 基因片段中序列完全相同。為進一步獲得6 株菌的分型信息，采用基于重復序列擴增技術的Diversilab 同源性分析系統(tǒng)進行實驗。對6 株菌分別采用DiversiLab 儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR 擴增試劑盒先進行擴增，后吸取1 ?L PCR 產(chǎn)物加入芯片的標本孔，進行電泳分離擴增的DNA的片段，采用儀器自帶軟件繪制基因分型同源性關系圖。
2 結(jié)果
2.1 菌株來源統(tǒng)計本次建庫收集到環(huán)境微生物分離菌株共計254 株，包括248 株細菌和6 株霉菌，所有的霉菌均來源于沉降菌收集。大部分菌株均來源于在微生物實驗室活動的人員(137 株)，占全部分離菌株的53.9%。其余環(huán)境沉降微生物(30 株)、環(huán)境浮游微生物(47 株)及來源于設備和材料表面的微生物(40 株)占全部分離菌株比例相差不大，分別為11.8%，18.5%和15.7%。
2.2 環(huán)境微生物菌庫的建立結(jié)合生化鑒定和測序鑒定結(jié)果的254 株微生物的鑒定結(jié)果統(tǒng)計見表1。其中葡萄球菌屬細菌最多，占全部分離菌的34.3%;其次為芽孢桿菌和微球菌，分別占全部分離菌的32.7%和12.6%。環(huán)境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77 株微生物，占污染微生物總數(shù)的30.3%。其中，芽孢桿菌、葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見環(huán)境菌。從設備材料和操作人員共收集分離表面微生物177 株，占污染微生物總數(shù)的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、藤黃微球菌和表皮葡萄球菌，分別占表面微生物總數(shù)的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鑒定和測序鑒定2 種方法對微生物實驗室環(huán)境中收集到的254 株菌進行鑒定，通過鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測實驗室環(huán)境微生物庫。
2.3 6 株金黃色葡萄球菌的同源性分析結(jié)果6 株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 系統(tǒng)進行同源性分析，實驗結(jié)果顯示6 株金黃色葡萄球菌高度同源，最低菌株間的親緣關系也達到99%(親緣關系>95%，即為同源)，所以6 株菌應該來自同一個污染源。
3 討論
從建立的環(huán)境微生物庫各方面的對比情況分析可知，大部分微生物均來源于微生物實驗室中活動的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細菌為人體易攜帶污染的微生物，這兩類微生物在多個采樣點均有發(fā)現(xiàn)，所以可能是由于人員活動或表面接觸帶來的交叉污染，表明操作人員攜帶的微生物是實驗室環(huán)境菌的主要來源之一，為了減少污染應嚴格控制人員的更衣和清潔程序。環(huán)境中同樣存在著多種芽孢桿菌，在環(huán)境中不易被消毒滅菌，可能是由于消毒頻次和消毒劑效力問題導致的殘留污染，應該增加消毒滅菌頻率并有計劃地更換消毒劑確保杜絕污染。本研究通過7 個月的持續(xù)采樣收集環(huán)境微生物，初步建立了藥品微生物檢測實驗室的環(huán)境微生物庫，但是環(huán)境微生物庫的建立是個持續(xù)動態(tài)的過程，因此需要在日常監(jiān)測中不斷完善。本次建庫采用微生物鑒定(生化鑒定和測序鑒定)和分型技術(Diversilab 同源性分析系統(tǒng))對微生物實驗室進行監(jiān)控，建立和健全了日常監(jiān)督檢查方法，為今后開展污染水平的風險評估和不良事件調(diào)查提供技術平臺，同時也為高風險藥品生產(chǎn)企業(yè)建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫提供技術指導。
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